Um método descrito por pesquisadores da Universidade Federal do Paraná (UFPR), que detecta um anticorpo do vírus da covid-19 a mais em relação aos testes-padrão, indica uma nova abordagem para os testes sorológicos usados no combate à doença. A inovação aprimora uma técnica tradicional de análise chamada citometria de fluxo, que avalia ao mesmo tempo diferentes parâmetros de células ou partículas das amostras de soro sanguíneo. A técnica foi descrita no trabalho preliminar “Multiplexed flow cytometric approach for detection of anti-sars-cov-2 IgG, IgM and IgA using beads covalently coupled to the nucleocapsid protein”, publicado em março no servidor ChemRxiv.

O método criado por cientistas do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas e do Departamento de Análises Clínicas da UFPR, em colaboração com outros departamentos da universidade e do Hospital Erasto Gaertner, em Curitiba, faz a detecção simultânea de anticorpos dos tipos IgG, IgM e IgA reagentes ao novo coronavírus. Como antígeno (partícula ligada ao vírus que, nos testes, ajudam a identificar os anticorpos), os cientistas usaram a proteína do nucleocapsídeo, que fica no interior do Sars-CoV-2, em vez da proteína Spike, presente no “envelope”, a camada externa do vírus.

De acordo com os autores do trabalho, não existem testes disponíveis comercialmente que detectem simultaneamente os três tipos de anticorpos. Também não consta nenhum teste para detecção de IgA na lista dos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA), agência federal do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos.

Os testes comerciais em geral medem apenas IgG e IgM. O cruzamento de informações sobre esses anticorpos é comum nas análises porque em tese eles são produzidos pelo organismo em momentos diferentes da infecção. Enquanto o IgM é produzido primeiro, o IgG surge depois, para atacar os antígenos (partículas invasoras) que restaram, e permanece por mais tempo no organismo.

Na pesquisa da UFPR, a inclusão da medição do IgA, um anticorpo produzido nas mucosas do corpo, permitiu que mais um dado ajudasse na melhoria do teste rápido para o vírus da covid-19. Os resultados do estudo com essa técnica apontaram sensibilidade e especificidade (termos empregados na descrição de precisão diagnóstica) semelhantes aos testes aprovados pela FDA.

“A detecção de IgA mostrou sensibilidade e especificidade aumentadas em comparação com um teste comercial do tipo Elisa [Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay, o padrão desse tipo de teste] e a análise combinada de IgG, IgM e IgA melhorou o diagnóstico sorológico”, explica o professor Glaucio Valdameri, do PPG em Ciências Farmacêuticas da UFPR.

Anticorpo presente em mucosas pode ser peça-chave
A sensibilidade está relacionada ao percentual de resultados positivos em um conjunto de pessoas com a doença, enquanto a especificidade está relacionada ao percentual de resultados negativos em um grupo de pessoas que não apresentam a doença. Na pesquisa, a sensibilidade identificada ficou entre 61% e 98% e a especificidade, entre 90% e 100%.

Os pesquisadores enfatizam a importância da detecção simultânea dos três tipos de anticorpos que, segundo a técnica descrita, aumenta a precisão diagnóstica.

“Estudos recentes sugerem que a investigação de um único tipo de anticorpo pode não ser suficiente no caso da covid-19. A investigação de IgA, em particular, parece ser de extrema importância, pois poderia estratificar a doença”, comenta a professora Vivian Rotuno Moure, do Departamento de Análises Clínicas da UFPR.

A técnica de detecção – utilizada atualmente para o monitoramento de pacientes com HIV, para o diagnóstico bacteriano e viral, entre outras finalidades – ainda é pouco utilizada para pesquisa de anticorpos em fluídos biológicos.

“Conhecemos apenas um outro estudo que emprega uma abordagem baseada em citometria de fluxo em sistema livre de células para avaliar a resposta imune humoral, mas não envolve a detecção dos três anticorpos simultaneamente”, revela Valdameri.

Da coleta de sangue ao resultado, o processo dura seis horas
O processo de testagem inicia com a coleta de sangue do paciente. No estudo, foram utilizadas amostras positivas para a covid-19 e negativas (de antes da pandemia) fornecidas pelo Hospital Erasto Gaertner. Após a obtenção do soro sanguíneo, ocorre a incubação do material com esferas de poliestireno (CBA) que imitam uma célula.

“Essas esferas comerciais possuem grupos químicos que permitem a ligação covalente com proteínas. Por isso, nós purificamos a proteína do nucleocapsídeo do Sars-CoV-2 e a ligamos na superfície dessas esferas”, indica Vivian.

As esferas são, então, incubadas com anticorpos comercialmente disponíveis. Esses anticorpos estão ligados com fluoróforos, moléculas que, após estímulos de um laser, emitem fluorescência. As análises são feitas à medida que as partículas suspensas na corrente de fluido passam por um feixe de luz do citômetro de fluxo.

Os pesquisadores utilizaram três anticorpos com fluoróforos distintos, cada um reconhecendo um alvo diferente, para conseguir detectar simultaneamente os três principais tipos de anticorpos anti-Sars-CoV-2: IgG, IgM e IgA. O processo todo dura, em média, seis horas.

A ferramenta apresentada pelos cientistas fornece, portanto, um modelo para o rápido desenvolvimento de avaliação de anticorpos para o coronavírus e para outras infecções emergentes.

Cientistas pretendem testar outras proteínas do vírus
Os dados apresentados pelos autores demonstram a primeira abordagem baseada na citometria de fluxo para determinação de respostas IgG, IgM e IgA para covid-19 como uma prova de conceito para estudos futuros. Apesar da inovação relacionada ao uso de esferas nessa técnica de investigação, o depósito de patente não foi realizado.

“Gostaríamos que outros pesquisadores, que possuam citômetros de fluxo em seus laboratórios, aplicassem esse conceito para o diagnóstico da covid-19 ou de outras doenças”, destaca Valdameri.

Os pesquisadores pretendem aprimorar o método incluindo outras proteínas do vírus e aplicar a metodologia a um grupo maior de amostras. “Também gostaríamos de identificar o perfil de cada um desses anticorpos ao longo do tempo em pacientes infectados com o Sars-CoV-2 e comparar com pacientes vacinados”, revela Vivian.

O laboratório tem apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Fundação Araucária e financiamento parcial da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes).